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    • 通过酶联免疫斑点法(ELISPOT)解决疫苗和新颖疗法带来的复杂问题


      临床领域加速涌现的新颖疫苗和免疫疗法催生了个体化用药、免疫分析和免疫监测等建立在日益复杂的测试平台上的新兴领域。其中,酶联免疫斑点(ELISpot)家族的免疫测定法是单细胞分析中最常用的功能性测定法。1

      ELISPOT图表借助来自Trialtrove(Citeline.com)的2017年数据,我们发现ELISpot检测方法被用于超过160项公开临床试验(图1)。临床使用日渐普及的主要推动因素有:

      • 随着发达国家人口出现老龄化,传染病和慢性病越来越流行。
      • 免疫测定法在肿瘤学新疫苗和免疫疗法中的广泛使用
      • 科技的发展,例如测试自动化和快速分析
      • 生物科技行业的增长

      寻找正确的斑点

      在酶联免疫斑点(ELISpot)测定法中,类似于ELISA的培养皿底部的抗体包被膜会收集到细胞分泌的分析物(细胞因子、免疫球蛋白等)。移除细胞后,收集到的分析物通过发色底物的沉积得到显现,从而导致斑点在膜上形成。 斑点代表着可分泌相关分析物的细胞、分泌的分析物量及其动力学。2之后,对斑点进行计数并产生定量报告,例如免疫或治疗之后抗原特异性T细胞3的频率。4用于检测人干扰素-γ的酶联免疫斑点(ELISpot)测定法为IFN-γ 酶联免疫斑点测定法。

      IFN-γ
       酶联免疫斑点测定法

      强大的淋巴细胞效应子功能的诱导对于新颖生物疗法的活动极为重要。 由于其已知作用,IFN-γ 已成为诱导细胞免疫反应的主要标记物。5-7相应地,在过去二十年里,IFN-γ 酶联免疫斑点测定法一直是用于检测并量化抗原特异性细胞反应的一种高度敏感而简单的平台。依据良好的临床实验室实践标准,它也已成为分析T细胞反应的指标,8被广泛用于疫苗、移植、HIV、癌症、过敏4,5,6,7以及更多其他领域。 IFN-γ 酶联免疫斑点测定法满足了临床试验持续评估中近55%的酶联免疫斑点测试需求。 鉴于此原因,以及业界持续扩大多功能细胞分析的应用9,10,人们对IFN-γ 酶联免疫斑点测定法的质量给予了高度关注。

      然而IFN-γ 酶联免疫斑点测定法并没有表面上看起来那么简单。由多家组织发起的熟练程度评估标本组得出的结果显示,相关参与实验室的报告结果存在巨大差异。11,12,13有多个受到严格控制的变量会对测定结果产生影响。其中包括试验培养基、抗原(刺激物)、细胞存储条件、细胞活力、工作人员培训水平以及酶联免疫斑点培养皿的实际计数和量化方法。

      酶联免疫斑点培养、定性和验证的整体性方法

      如果不对检测方法的变量和样本完整性加以控制,任何酶联免疫斑点测试解决方案要在临床试验中成功实施都将成为空谈。 Covance IFN-γ 酶联免疫斑点集成解决方案包括一支专门的靶细胞分离团队,该团队负责处理/生产检测方法中使用的细胞组分(外周血单个核细胞、T细胞、B细胞等),避免成本高昂的样本处理,并使冷冻活细胞装运至各个专业实验室所产生的风险和额外费用降至最低。

      与此类似,对法规的精通、全球业务覆盖、可靠的物流以及(根据特定的研究需求)可随测试量增加进行扩展的专门的酶联免疫斑点解决方案都是能否成功使用酶联免疫斑点开展临床试验计划的关键因素。Covance的中心实验室(CLS)在一处设施内提供基因组学, 流式细胞计量术组织学等领域的各种测试,因为这些测试可产生与酶联免疫斑点测定法相关测试互补的数据。这使发起人能够创建功能性免疫档案,其中收集了临床试验受试者的总体细胞免疫状况。

      Covance通过转化生物标记物解决方案实验室提供IFN-γ 酶联免疫斑点测试已有数年之久。 更重要的是,Covance刚刚在我们位于印第安纳波利斯的疫苗和新型免疫治疗实验室(隶属于CLS)增加了IFN-γ 酶联免疫斑点能力,为发起人提供了在其临床测试计划中采用IFN-γ 酶联免疫斑点测定法的一站式解决方案。

      面向未来

      除了对分泌的细胞因子进行传统的色度量化之外,Covance酶联免疫斑点平台还实现了多重FluoroSpot检测方法(图2)的研发和执行。FluoroSpot是下一代酶联免疫斑点,可实现不同分析物的同时测定。14,15 使用模块化方法验证新型FluoroSpot检测方法的能力带来了即用灵活性,这有助于缩短特定发起人的抗原和靶标的研发时间。Covance疫苗和新型免疫治疗实验室的酶联免疫斑点平台具有面向未来的设计,可为该领域未来的发展提供支持。


      参考资料
      1-Czerkinsky CC等人,J Immunol Methods。1983;65:109-121。
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      5- Flynn K.等人,Immunity。1998;8:683-691。
      6- Bercovici N等人,Clin Diag Lab Immunol。2000;7:859-864。
      7- Carter LL、Swain SL。 Curr Opin Immunol。1997;9:177-182。
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      11- Janetzki S等人,Cancer Immunol Immunother。2008;57:303-315。
      12- Britten C.M等人,Cancer Immunol Immunother。2008;57:289-302。
      13- Cox J.H等人,AIDS Res Hum Retroviruses。 2005;21:68-81。
      14- Janetzki S等人,Cells。2014;3(4):1102-1115。
      15- Gazagne A等人,J Immunol Methods。2003;283(1-2):91-98。

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