肿瘤学临床试验

荧光流式细胞术用于筛查癌细胞和免疫细胞中的细胞内信号传导事件

有关阻断疾病相关激酶活性的小分子抑制剂研发的临床前研究仍然是癌症治疗的主要重点。因此,可以量化这些激酶的磷酸化状态的强大平台对药物研发工作很有价值。通过使用MV-4-11急性骨髓性白血病(AML)模型,此更新介绍了科文斯新的活体内活体外磷酸流服务,该服务可一致、反复地测量磷酸激酶信号。该平台使用荧光标记的抗体,这种抗体仅在调节其功能的特定氨基酸残基上被磷酸化时才能识别蛋白质。此外,我们展示了磷酸流如何将高通量免疫表型与磷酸蛋白检测整合在一起,这比基于ELISA的检测方法和其他常规技术具有优势。

稳态与癌症发作之间的转换由调控基因表达的细胞内信号传导系统的复杂网络控制。这些分子机制由驱动多种生物学功能的一系列信号蛋白组成。其中包括但不限于细胞周期调节、细胞凋亡、细胞存活、血管生成、细胞迁移和免疫应答。这些机制中任何一种的失调都有可能通过阻断宿主控制细胞增殖以及肿瘤生长和/或随后转移性疾病的能力来促进癌症发病。1,2,3

图1中的示意图说明了磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B (AKT)/雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)机制的组成性激活可促进肿瘤生长。各种机制的激活在很大程度上受蛋白激酶的控制,蛋白激酶是通过在丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上添加一个磷酸基团而启动下游蛋白的酶。这些蛋白质的磷酸化状态通常用作信号激活的指示。相反,可以通过去除这些磷酸基团的蛋白质磷酸酶来停止细胞信号传导。

为了说明如何使用磷酸流测量蛋白质磷酸化的变化,我们用Merck & Co.开发的泛AKT抑制剂MK-2206对MV-4-11细胞进行了体外处理(Selleckchem;德克萨斯州休斯顿)。图2显示,在处理2个小时和24个小时后,MK-2206诱导MV-4-11细胞中的AKT和S6去磷酸化。用MK-2206处理也会诱导凋亡,这可以通过半胱天冬蛋白酶-3激活和膜联蛋白V结合来测量(图3)。

MK-2206处理可降低MV-4-11细胞培养中的AKT和S6磷酸化

图2:MK-2206处理可降低MV-4-11细胞中AKT和S6的磷酸化水平。将MV-4-11细胞接种到培养板中,并用10 µM MK-2206处理或不进行处理。通过磷酸流测量p-AKT和p-S6水平。直方图叠加图和条形图均显示了中值荧光强度(MFI)。红色和蓝色直方图分别代表经过MK-2206处理和未经处理的培养物。按照每个实验条件进行两次实验。所示数据代表三个实验。

MK-2206诱导MV-4-11细胞凋亡

为了证明磷酸流可以产生与常规技术相似的结果,进行了蛋白质印迹分析,揭示了在MK-2206处理后AKT和S6脱磷酸的相似模式(图4)。

图4:蛋白质印迹分析所产生的结果与磷酸流分析相符。MV-4-11细胞用10µM MK-2206处理,或保持不处理24小时。将总蛋白提取物转移到PVDF膜上,并用抗p-AKT(Ser473)和抗p-S6(Ser240/244)抗体进行探测以测量磷酸化水平。密度计显示,MK-2206处理将p-AKT和p-S6信号分别降低了13.2%和34.1%。探测α-微管蛋白作为上样内参。

为证明如何将磷酸流与免疫表型结合使用,对具有弥散性MV-4-11肿瘤细胞的小鼠给予MK-2206或溶剂对照,并以磷酸流法对AKT和S6的磷酸化进行离体测定。图5显示,体内 MK-2206处理可诱导骨髓MV-4-11肿瘤细胞中AKT和S6的去磷酸化,但小鼠淋巴细胞中只有AKT去磷酸化。

体内MK-2206治疗对AKT和
S6磷酸化的影响在肿瘤和宿主细胞中是不同的

图5:体内用MK-2206处理可降低流式细胞仪在骨髓MV-4-11肿瘤细胞中检测到的p-AKT和p-S6水平。携带弥散性MV-4-11肿瘤的小鼠在植入后第17天和18天被给予MK-2206 (180 mg/kg)或溶剂(N=5小鼠/组)两次。在第19天,从股骨和胫骨冲洗出骨髓进行分析。分别用抗人CD45和抗小鼠CD45抗体对样本进行染色,采用免疫分型技术区分MV-4-11肿瘤细胞(上图)与小鼠淋巴细胞(下图)。数据表示为平均值±SD。使用学生t检验进行统计分析。

以上结果表明,磷酸流具有多种用途。它是一种用于筛选新药对体外细胞信号通路激活作用的重要工具。磷酸流还可通过将该技术与免疫表型细胞表面标记物相结合来区分不同细胞亚群中的分析而在体内测量药物作用。

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1Marmiroli、Sandra等人。"磷酸化、信号传导和癌症:靶点和靶向。" 《BioMed Research International》 2015 (2015)。

2Bianco、Roberto等人。"将关键的癌细胞信号传导途径作为治疗靶标。" 《European Journal of Cancer》 42.3 (2006): 290-294。

3Nitulescu、George Mihai等人。"Akt抑制剂在癌症治疗中的作用:从药物筛选到临床使用的漫长旅程(综述)。" 《International Journal of Oncology》48.3 (2016): 869-885。

4Min, Y. H.等人。"急性髓性白血病中Akt/PKB蛋白的组成型磷酸化:其作为预后变量的意义。" 《Leukemia》 17.5 (2003): 995-995。

5Lu, Jeng-Wei等人。 "MK-2206诱导AML细胞凋亡并增强阿糖胞苷的细胞毒性。" 《Medical Oncology》32.7 (2015): 1-9。

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