hPBMC在临床前用于免疫肿瘤学建模的最新进展

作者:

Sheri Barnes博士

日期:

2020年7月


2月份,我们提供了科文斯利用人外周血单核细胞(aPBMC)植入的新兴人源化小鼠平台的初始数据。

我们使用NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠的数据确定了四个hPBMC供体,这些供体表现出hPBMC注射后至少30天的治疗窗口、一致的T细胞植入以及在hPBMC植入NSG小鼠中两种人类异种移植模型MiaPaCa-2(胰腺)和A549(NSCLC)的稳健生长。

现在,我们展示了具有MiaPaCa-2或A549人类异种移植物的hPBMC植入NSG小鼠在接受pembrolizumab(Keytruda®,一种抗hPD-1)治疗后的初步功效数据。

实验设计

这些研究的目的是评估在NSG小鼠中植入hPBMC后,pembrolizumab对MiaPaCa-2或A549人类肿瘤模型的抗肿瘤反应。在AAALAC认可的研究中心,按照《实验动物饲养管理和使用指南》进行动物饲养管理和使用。

肿瘤一旦形成(~105-118mm3),则从三个不同的正常健康供体(Hemacare,美国加利福尼亚州洛杉矶)对NSG小鼠(Jackson Laboratories,美国缅因州巴港,品系#0005557)进行静脉注射hPBMC。hPBMC注射后第二天开始用pembrolizumab治疗。 确定了对pembrolizumab的反应,评估了移植物抗 宿主病(GvHD)样特征的发作,并在两个时间点收集了全血,用于人淋巴细胞标记的流式细胞术分析,以确认供体植入了CD45+细胞,包括CD4+和CD8+ T细胞。

MiaPaCa-2和A549控制hPBMC植入小鼠的肿瘤生长

未经治疗的对照动物的MiaPaCa-2肿瘤倍增时间(Td)为约7天,每个供体组中,给予hPBMC的动物的肿瘤倍增时间为约5至7天。

到第36天,所有三个供体的肿瘤均生长到1000-1200mm3的平均肿瘤体积,但是,在36天之后观察到组内和组间的某些差异。1000mm3之前的肿瘤生长似乎不受hPBMC植入的影响(图1)。

这些结果表明,利用这三个供体中的任何一个都适合MiaPaCa-2功效研究,生长到评估大小的时间(TES)为1000mm3

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图1.  hPBMC给药后,对照组MiaPaCa-2皮下肿瘤的生长

 

A549 未经治疗的对照组动物的肿瘤倍增时间为约11天,在每个供体组中,给予hPBMC的动物的肿瘤倍增时间为9至12天。

到第40天,来自供体1和3的hPBMC肿瘤平均生长至1000-1200mm3的平均肿瘤体积,并在第40天之后看到了一些生长变化。 

组内变异在携带A549肿瘤和来自供体2的hPBMC的小鼠中最为明显(图2)。 

这些结果表明,供体1和3最适合用于A549 TES为1000mm3的功效研究。

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图2. hPBMC给药后对照组皮下A549肿瘤的生长

 

人淋巴细胞的植入和持久性

在hPBMC给药后第28天和第38天(MiaPaCa-2)或第42天(A549)通过免疫表型分析研究小鼠外周血中的人类免疫细胞标记物。 

流式细胞仪标记物包括mCD45、hCD45、hCD3、hCD4和hCD8。人CD45+细胞,占携带MiaPaCa-2(图3A)或A549肿瘤(图3B)的动物体内活细胞的百分比显示如下,并用作hPBMC植入的指标。 

我们发现在两个时间点所有供体中均检测到全血中的hCD45+细胞,并且与已发表的文献一致。1

虽然组内变异性很明显,但在第一时间点和第二时间点之间的平均植入程度保持一致或增加。在携带A549肿瘤的动物中,hPBMC的植入程度看起来确实高于携带MiaPaCa-2肿瘤的动物,这与我们最初的模型研发数据一致。 

目前,尚不清楚这是研究之间的正常差异还是模型对移植的依赖性。  

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图3. 从给予hPBMC并携带MiaPaCa-2 (A)或A549 (B)异种移植物的NSG小鼠的全血中检测到的hCD45+细胞的植入。

 

图4举例说明了CD4+和CD8+ T细胞在全血中的分布情况,并说明了T细胞的分布情况在不同时间点之间保持一致。 

尽管这些数据仅代表携带MiaPaCa-2肿瘤的小鼠中的供体1,但在所有供体和测试模型中报告了相似的数据。 

具体来说,在携带MiaPaCa-2的小鼠中,CD4+和CD8+ T细胞的分布范围为42-65%至32-46%,在携带A549的小鼠中,分布范围分别为51-67%至22-44%(数据未显示)。 

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图4. 从给予供体1 hPBMC、携带MiaPaCa-2的NSG小鼠全血中检测到的hCD4 +和hCD8+ T细胞的植入(占hCD45+细胞的百分比)。

 

通过体重和临床观察监测GvHD症状的发作。尽管在这些研究中未在病理学上得到证实,但在这些模型中观察到的症状与疾病2以往的数据密切相关(数据未显示)。

对Pembrolizumab的反应

有趣的是,在测试的条件下,pembrolizumab治疗在接受hPBMC移植的小鼠中未对任何供体的MiaPaCa-2或A549肿瘤的生长产生影响(图5和6)。 

截至本文发布时,关于在携带MiaPaCa-2肿瘤、接受hPBMC移植的人源化小鼠中,对pembrolizumab的体内反应缺乏文献报道。 

尽管如此,我们的数据仍反映了有关胰腺肿瘤对免疫肿瘤药物治疗无反应的广泛文献。3 如先前报道,pembrolizumab对A549似乎产生了中度反应,并且该反应似乎具有供体依赖性。4

尽管始终缺乏pembrolizumab对A549或MiaPaCa-2的反应,但这些模型对于将抗hPD-1作为合理联合用药方案的治疗方法仍有用处,因为对于不同供体之间的差异性反应具有很大的改进和评估空间。  

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图5. 给予hPBMC和同种型对照或pembrolizumab(抗hPD-1)治疗后MiaPaCa-2皮下肿瘤的肿瘤生长
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图6. 给予hPBMC和同种型对照或pembrolizumab(抗hPD-1)治疗后A549皮下肿瘤的肿瘤生长

 

向NSG小鼠给予hPBMC可导致人类T细胞在小鼠中持久存在,对MiaPaCa-2或A549肿瘤的生长影响最小。 该方法代表了一个强大的临床前平台,可用于研究利用人类T淋巴细胞指导直接抗肿瘤活性的新型人类药物的作用,并具有直接的临床意义。

未来研究将使用流式细胞术来分析针对hPBMC重构的NSG小鼠中人肿瘤异种移植物采用FDA批准的免疫疗法后,人类T细胞在肿瘤和周围组织中的浸润。

科文斯可将这些人类PBMC供体的储备库提供给您,以满足您的研究需求。  请联系我们的临床前肿瘤学科学家,查看植入hPBMC的NSG小鼠如何用于您的下一次转化免疫肿瘤学研究


参考文献:

1.Todd Pearson、Dale L. Greiner和Leonard D. Shultz。建立“人源化”小鼠以研究人类免疫力。2008. Curr Protoc Immunol 第15节:15.21单元

2.Sina Naserian、Mathieu Leclerc、Allan Thiolat、Caroline Pilon、Cindy Le Bret、Yazid Belkacemi、Sébastien Maury、Frédéric Charlotte和José L. Cohen. 简单、可重现和高效的急性移植物抗宿主病小鼠模型的临床评分系统。2018. Front. in Immun. (9): 10.

3.Robert J. Torphy、Yuwen Zhu和Richard D. Schulick。胰腺癌的免疫疗法:障碍和突破。2018。 Ann Gastroenterol Surg. 2(4): 274–281.

4.Shouheng Lin、Guohua Huang Lin Cheng、Zhen Li、Yiren Xiao、Qiuhua Deng、Yuchuan Jiang、Baiheng Li、Simiao Lin、Suna Wang、Qiting Wu、Huihui Yao、Su Cao、Yang Li、Pentao Liu、Wei Wei、Duanqing Pei、Yao Yao、Zhesheng Wen、Xuchao Zhang、Yilong Wu、Zhenfeng Zhang、Shuzhong Cui、Xiaofang Sun、Xueming Qian和Peng Li。建立用于研究PD-L1/PD-1靶向免疫疗法疗效的外周血单核细胞源性人源化肺癌小鼠模型。2018。 MAbs. 10(8): 1301–1311.