通过酶联免疫斑点和荧光耦联免疫斑点测量肿瘤抗原特异性免疫

作者:

David Draper

日期:

2020年3月

 

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肿瘤抗原特异性应答的增强是免疫疗法的预期结果。无论是通过抗肿瘤免疫力的急剧提高,还是长期免疫记忆的形成,成功增强宿主适应性免疫应答的药物都有更大的临床成功机会1。尽管有许多测定方法可用于测量抗原特异性,但许多测定方法都有局限性,因为需要使用模型特异性试剂、基因重组动物或细胞亚群纯化步骤。科文斯临床前肿瘤学通过ELISpot/FluoroSpot分析提供了一种简单且价格合理的解决方案。

ELISpot和FluoroSpot使用基于三明治法ELISA的技术来测量细胞产生和释放可溶性靶标的频率。商用试剂盒可用于测量靶标,包括细胞因子、趋化因子、免疫球蛋白、生长因子等。科文斯提供单个靶标(酶联免疫斑点)的单色酶联免疫斑点分析(ELISpot)以及同时针对多达3个靶标的多色荧光分析(FluoroSpot)。图1展示了用于分析产生肿瘤特异性IFNγ和IL-4细胞的FluoroSpot程序的示意图。

图1:ELISpot/FluoroSpot程序
图1:ELISpot/FluoroSpot程序

在此技术聚焦中,我们展示了ELISpot/FluoroSpot在使用Hepa1-6-luc鼠肝细胞癌模型的临床前免疫肿瘤学研究中的应用(图2)。为此,我们使用FluoroSpot测量了荷瘤小鼠外周血中的肿瘤特异性免疫力,并表明抗PD-1治疗的体内检查点抑制作用增加了产生IFNγ的循环肿瘤特异性细胞的数量。此外,抗PD-1使IFNγ/IL-4细胞因子表达谱从免疫抑制向促炎性和抗肿瘤特征转变。

图2:Hepa1-6-luc荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫力FluoroSpot分析。 对具有已建立Hepa1-6-luc肿瘤的C57BL/6小鼠给予抗PD-1或同种型对照抗体。 将来自200µL外周血的白细胞与辐照的Hepa1-6-luc细胞一起培养。 A)使用CTL ImmunoSpot® S6通用分析仪对IFNγ和IL-4分泌细胞的频率进行定量测量。 B) 分析每只小鼠中产生IFNγ的细胞频率与肿瘤体积的关系。 C). 通过测量产生IFNγ/IL-4的细胞的比例评估每只小鼠中的Th1/Th2平衡。
图2:Hepa1-6-luc荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫力FluoroSpot分析。对具有已建立Hepa1-6-luc肿瘤的C57BL/6小鼠给予抗PD-1或同种型对照抗体。将来自200µL外周血的白细胞与辐照的Hepa1-6-luc细胞一起培养。A)使用CTL ImmunoSpot® S6通用分析仪对IFNγ和IL-4分泌细胞的频率进行定量测量。B) 分析每只小鼠中产生IFNγ的细胞频率与肿瘤体积的关系。C). 通过测量产生IFNγ/IL-4的细胞的比例评估每只小鼠中的Th1/Th2平衡。

与疫苗的作用机制相似,生长中的肿瘤会引发适应性免疫反应,该反应由抗体和产生细胞因子的肿瘤特异性细胞1组成。反应的质量可以通过检测IFNγ和IL-4表征。已有文献充分证明,IFNγ通过增强细胞毒性介导的T细胞来抑制肿瘤生长。相反,IL-4可通过各种免疫抑制作用促进肿瘤生长。这种此消彼长通常称为Th1/Th2平衡2。如图2所示,在体外刺激后,抗PD-1增加了产生IFNγ的肿瘤反应细胞的频率。相反,产生IL-4的细胞的频率并未显著增加,表明检查点抑制触发了抗肿瘤保护性免疫的增强。为此,具有最高的IFNγ产生频率的细胞的小鼠所携带的肿瘤体积最小。此外,抗PD-1还增加了产生FNγ/IL-4的细胞的比例,这在肿瘤最小的小鼠中也最明显。

综上所述,该数据集证明了ELISpot/FluoroSpot可进一步揭示药物对肿瘤特异性免疫反应的影响。此外,由于可以用少量血液进行测定,因此可以将ELISpot/FluoroSpot纵向应用于不同的功效组。因此,创造了在不为研究增加第二个采样组的情况下了解药物活性机制的机会。有关如何将ELISpot/FluoroSpot应用于临床前肿瘤学和免疫肿瘤学研究的更多信息,请与科文斯临床前肿瘤学科学家联系。

参考文献:

1.免疫;52.1 (2020): 36-54

2. 癌症免疫学;免疫疗法;57.8 (2008): 1125-1136.