使用细胞因子/细胞毒性测试套组通过流式细胞术进行肿瘤浸润淋巴细胞的功能分析

作者:

David Draper,博士

日期:

2020年8月

促炎性细胞因子反应与颗粒酶B和CD107a(LAMP-1)的表达相结合是免疫肿瘤学领域中的重要生物标记物1-3。基于细胞的检测方法可以对这些靶标在肿瘤来源的效应淋巴细胞中的表达进行量化,从而为候选药物的作用机理提供洞见。科文斯的临床前肿瘤学小组提供了一种新的现成检测方法,该方法利用细胞因子/细胞毒性标准流式细胞术测试套组对T细胞、自然杀伤(NK)和自然杀伤T细胞(NKT)亚群中的这些终点进行定量。本技术聚焦展示了如何将Cytokine/Cytotoxicity™测试套组整合到体内研究中,并结合常规免疫表型分析,帮助在临床前药物研发过程中建立可靠的数据集。

包括IFNγ、TNFα和IL-2在内的细胞因子通过促进肿瘤微环境中先天性和适应性免疫细胞活化以及T细胞增殖而具有抗肿瘤活性。通过直接或间接机制以T细胞活化来抑制肿瘤生长的体内治疗方法通常会增加肿瘤浸润T细胞的频率,这些细胞被转变为始发态以强烈响应离体刺激。已证实NK和NKT细胞在始发态和后续的IFNγ/TNFα产生方面发生类似的作用。除了产生细胞因子外,体内治疗还可以诱导效应淋巴细胞获得增强的细胞毒性,从而通过直接的细胞间接触机制使肿瘤细胞裂解。该流程由来自免疫细胞内部储存的溶细胞颗粒的穿孔蛋白和颗粒酶的表达和释放介导。这些毒素会破坏细胞膜并诱导靶肿瘤细胞凋亡。此外,脱颗粒还与效应细胞表面的CD107a表达相吻合,因此可以用作细胞毒活性的标记物。

综合来看,可剖析上述特征以审视肿瘤微环境中淋巴细胞亚群的活化状态。细胞因子/细胞毒性测试套组通过结合使用T细胞、NK和NKT细胞特异性抗体的细胞表面免疫表型分析与细胞因子和颗粒酶B表达的细胞内染色来进行这些测量(表1)。

表1:细胞因子/细胞毒性测试套组

抗体/染料

描述

CD45

全造血系细胞标记物

CD3

泛T细胞标记物

CD4

CD4+ T细胞标记物

CD8

CD8+ T细胞标记物

CD49b/CD335

天然杀伤细胞/天然杀伤T细胞标记物

IFNγ

促炎性细胞因子

TNFα

促炎性细胞因子

IL-2*

T细胞活化剂

粒酶B

细胞毒性标记物

CD107a

脱颗粒标记物

活性染料

死细胞排除

*IL-2可用其他细胞因子替代,包括IL-4和IL-17a

 

放射和抗mCTLA-4治疗后4T1-luc肿瘤衍生效应细胞中细胞因子和颗粒酶B的分析

使用小鼠4T1-luc乳腺癌模型在该数据集中证明了细胞因子/细胞毒性测试套组测量细胞因子和颗粒酶B的效用。图1显示了用于描绘T细胞和NK细胞亚群的设门策略。与我们所有的临床前肿瘤流式细胞术测试套组一样,分析的起点为排除死细胞和随后对CD45+免疫细胞进行描绘,以鉴定目标免疫亚群(未显示)。在PPMA/离子霉素刺激后,IFNγ、TNFα、IL-2和颗粒酶B表达的代表图谱如图所示。 

图1:通过流式细胞术对淋巴细胞亚群中促炎性细胞因子和粒酶B设门
图1:通过流式细胞术对淋巴细胞亚群中促炎性细胞因子和粒酶B设门

4T1-luc肿瘤微环境具有高度的免疫抑制作用,其特征是存在大量的粒细胞髓样来源的抑制细胞浸润(未显示)。4T1-luc是已知对检查点抑制疗法有抗性的模型。但是,与小型动物放射研究平台(SARRP,Xstrahl)的放射治疗联合使用时,抗mCTLA-4会改善4T1-luc肿瘤的生长抑制(图2A,左)。与同种型对照组相比,在任何体内治疗条件下,流式细胞术均未显示肿瘤中T细胞或NK细胞计数增加,因此肿瘤生长抑制可能不是由于治疗诱导的效应细胞募集增加所致(图2A,右)。然而,PMA/离子霉素对肿瘤来源细胞的离体刺激显示,CD8+ T细胞具有更高的产生IFNγ的能力。另外,与对照组相比,NK细胞的颗粒酶B表达水平更高(图2B)。这些数据表明,放射和抗mCTLA-4联合治疗增强了CD8+ T细胞和NK细胞的活化状态。这证明了在针对功效和免疫表型的研究中纳入机制标记物的价值。

图2 - 细胞因子细胞毒性测试套组
图2:对4T1-luc模型中效应细胞的促炎性反应分析。对已形成4T1-luc肿瘤(n=6/组)的BALB/c小鼠给予抗mCTLA-4(克隆9D9)、局灶辐射(“RAD”;SARRP,Xstrahl Inc.)、两者联合或同种型对照抗体治疗。将肿瘤分离成单细胞悬液(gentleMACS™,Miltenyi Biotec),并在数据采集之前用荧光抗体标记。对于细胞因子和颗粒酶B分析,在存在布雷菲德菌素A的情况下,用PMA/离子霉素离体刺激肿瘤衍生细胞5小时。培养后,收集细胞并进行免疫染色以检测细胞内靶标。在Attune™ NxT(ThermoFisher Scientific)流式细胞仪上采集数据,然后使用Flowjo软件(BD)进行分析。

 

抗mCTLA-4治疗后CT26肿瘤衍生效应细胞中的脱颗粒分析

CD107a在脱颗粒过程中在细胞表面表达,并且是通常用于测量治疗诱导的细胞毒活性影响的标记物。细胞因子/细胞毒性测试套组用于检查抗mCTLA-4对小鼠CT26大肠癌模型中淋巴细胞的细胞毒性和肿瘤生长的影响。用抗mCTLA-4治疗的CT26荷瘤小鼠产生了74%的肿瘤生长抑制反应(图3A)。为研究细胞毒性,在用PMA/离子霉素对肿瘤衍生细胞进行离体刺激后,测量了CD8+ T细胞、NK和NKT细胞中CD107a和颗粒酶B的表达。代表表达图谱如图3B所示。分析表明,与同型对照治疗的动物相比,抗mCTLA-4治疗触发了所有三个亚群中CD107a表达的增加。这与NK和NKT细胞中颗粒酶B表达水平的降低相吻合。数据表明,在脱颗粒过程中,NK和NKT细胞中储存的颗粒酶B被耗尽。请注意,CD8+ T细胞颗粒酶B的表达在两组之间没有差异,这可能是治疗和脱颗粒率触发的颗粒酶B再次表达平衡所致。综合来看,该表型与治疗诱导的细胞毒性增强和直接杀死肿瘤细胞的潜力相一致。

图3 - 细胞因子细胞毒性测试套组
图3:CT26模型中的细胞毒性分析。向已形成CT26肿瘤(n=10/组)的BALB/c小鼠给予抗mPD-1(克隆RMP1-14)或同种型对照抗体。如上所述进行离体刺激和免疫表型测定。

 

定制 - 配置测试套组以定制细胞因子反应

细胞因子/细胞毒性测试套组已经过预先配置以测量促炎性细胞因子。该测试套组也可以定制以检测其他细胞因子反应。例如,辅助性CD4+ T细胞分化为不同的CD4+效应子表型,其中包括Th1、Th2和Th17。这些亚群在肿瘤发病机理中具有不同的作用。Th1细胞的特征在于释放的IFNγ,而Th2和Th17的特征在于产生IL-4和IL-17。细胞因子/细胞毒性测试套组可进行定制以纳入IL-4和IL-17A,从而促进对肿瘤微环境中辅助T细胞分化的治疗诱导效应进行机理分析。

如要了解有关如何将细胞因子/细胞毒性测试套组整合到临床前肿瘤学研究中的更多信息,请与科文斯的科学家联系。

请注意,所有动物护理和使用均根据动物福利法规在AAALAC认可的研究中心进行,并经过IACUC协议审查和批准。

 

1. Clynes, R. A.和Desjarlais, J. R.(2019)。癌症治疗中重定向的T细胞毒性。 《Annual Review of Medicine》70,437-450。

2. Miller, J. S.和Lanier, L. L.(2019)。癌症免疫治疗中的自然杀伤细胞。 《Annual Review of Cancer Biology》3,77-103。

3. Bae, E. A.、Seo, H.、Kim, I. K.、Jeon, I.和Kang, C. Y.(2019)。NKT细胞在癌症免疫治疗中的作用。 《Archives of Pharmacal Research》,1-6。