深入研究浸润肿瘤的T细胞免疫表型

在这篇技术文章中,我们通过展示使用新的Expanded CompT™测试套组(一种16色测试套组)生成的数据来演示后者的功能,该测试套组将T细胞激活和分化的流动分析提高到超过科文斯服务组合中其他任何测试套组的水平。

作者:

David Draper博士 | 科研助理总监

日期:

2019年8月

使用大型抗体组合的流式细胞仪具有检测更多细胞亚群的优势。当需要全面的数据集,但可用于分析的肿瘤材料有限时,这一优势尤为重要。此外,具有大量抗体的试剂组也可以用于对多个亚群进行深入的免疫表型分析,甚至可以对单个亚群进行更深入的分析。在这篇技术文章中,我们通过展示使用新的Expanded CompT™测试套组(一种16色测试套组)生成的数据来演示后者的功能,该测试套组将T细胞激活和分化的流动分析提高到超过科文斯服务组合中其他任何测试套组的水平。

扩展型CompT™试剂组以CompT™试剂组为基础,后者是我们最受欢迎的标准试剂组,可用于检测CD4+和CD8+ T细胞。经过改进的试剂组增加了效应子和记忆T细胞标记物,此外还有用于分析T细胞活化和衰竭的四个其他标记物。表1描述了扩展型CompT™试剂组的组成,并使用未经治疗的鼠C38结肠腺癌(图1)说明了其设门和分析策略。

  

抗体/染料 描述
CD45 泛免疫细胞标记物
CD3 泛T细胞标记物
CD4 CD4+ T细胞标记物
CD8 CD8+ T细胞标记物
FoxP3 调节性T细胞标记物
CD25 调节性T细胞标记物/IL-2受体
CD44 活化/记忆标记物
CD62L 幼稚T细胞/记忆标记物
Ki-67 增殖标记物
CD69 T细胞活化标记物
PD-1 T细胞活化/衰竭标记物
LAG-3 T细胞活化/衰竭标记物
TIM-3 T细胞衰竭标记物
ICOS T细胞活化标记物
粒酶B 抗肿瘤细胞毒性标记物
活性染料 死细胞排除
扩展型CompT™可进行定制,以纳入NK/NKT细胞标记物(CD49b/CD335),以使粒酶B和活化标记物在这些亚群中表达。


与所有科文斯T细胞试剂组一样,分析从排除死细胞开始,随后进行CD45+免疫细胞划定以圈选CD3+ T细胞(未显示)。图1A显示了CD4+和CD8+ T细胞分析在CompT™和扩展型CompT™试剂组之间共同的下游端点。其中包括CD69和PD-1,两者会在T细胞活化后上调。其表达与衰竭的T细胞表型相关。[1] 另一个共同的终点是CD8+ T细胞增殖,通过使用Ki-67表达作为替代标记物实现。最后,检测CD4+ T细胞以定量辅助性T细胞和调节性T细胞(Tregs)。图1B和1C说明了用于在CompT™试剂组基础上进行扩展的新增终点,下文将对这些终点进行进一步说明。

 

图1:使用扩展型CompT™试剂组分析T细胞
图1:使用扩展型CompT™试剂组分析T细胞 幼稚MC38肿瘤采集自C57BL/6小鼠。(A) CD4+辅助细胞、CD8+ T细胞和Treg定量,包括对增殖的测量(Ki-67分析)和CD69/PD-1标记物表达。(B) 效应子/记忆CD8+ T细胞分析,以量化幼稚、Teff、Tem和Tcm亚群。(C) 对于T细胞活化/衰竭标记物的扩展分析包括粒酶B。红色峰代表靶标染色的细胞。蓝色峰代表未染色的阴性对照。


效应子和记忆CD8+ T细胞分化的分析如图1B所示。T细胞向记忆表型的转化对于在感染和癌症发病机理背景下对再激发产生持久的免疫应答至关重要。CD44和CD62L分析可将T细胞划分为四个分化状态。其中包括幼稚或灭活T细胞、活化效应子T细胞(Teff)、效应记忆(Tem)和中央记忆(Tcm)亚群。Tem和Tcm亚群可以循环,但分别倾向于存在于非淋巴和淋巴组织中。[2] 近期的报告表明,这两个亚群在抗肿瘤反应中具有不同的作用。最近,第三种常驻记忆(Trm)种群据称在各模型中均在控制肿瘤生长方面发挥着重要作用,并可使用CD103以及其他标记物来描述。[3]扩展型CompT™试剂组可定制以纳入Trm细胞分析。

  

扩展型CompT™试剂组包括ICOS、LAG-3、TIM-3和粒酶B分析,这是针对T细胞功能得到深入研究的四种生物标记物(图1C)。单独或联合分析这些靶标可以深入了解CD8+ T细胞的抗肿瘤潜力。证据支持ICOS受体信号传导具有协同刺激作用和抗肿瘤作用,因此使ICOS成为有吸引力的治疗靶标。[4]粒酶B通常被用作细胞溶解活性的生物标记物,并且与CD8+ T细胞的抗肿瘤反应相关。相反,PD-1、LAG-3和TIM-3是抑制性受体,尽管这三种受体的表达与T细胞衰竭有关,但越来越多的数据表明,表达衰竭PD-1的CD8+ T细胞中存在亚群之间的异质性。[5]这种异质性与这些抑制受体的表达模式相关。此特征可帮助定义具有不同潜力的不同子群,这些子群体具有重新活化以增殖和/或裂解肿瘤细胞的独特潜力。[6] 图2说明了扩展型CompT™试剂组如何量化具有抑制受体双重和三重阳性表达的细胞,并深入剖析了表达T细胞亚群的异质PD-1及其功能。多种其他T细胞活化和抑制受体已得到描述,并会影响肿瘤的免疫反应。其中包括TIGIT、OX-40、CD137、CTLA-4等。科文斯具有在离体肿瘤分析中分析多种此类标记物的经验。只需开展极少的研发工作,即可对扩展型CompT™进行定制,以满足您独特的临床前需求。

未经治疗的MC38肿瘤衍生的细胞中T细胞活化/衰竭标记物的多重分析。
图2:未经治疗的MC38肿瘤衍生的细胞中T细胞活化/衰竭标记物的多重分析。扩展型CompT™试剂组可同时测量多种T细胞生物标记物在衰竭和抗肿瘤活性方面的共表达。本例中,首先对PD1+ CD8+ T细胞进行了圈选。然后,下游分析定量具有PD-1、LAG-3和TIM-3双重和三重阳性表达的细胞。


科文斯可以使用多达18种颜色配置自定义试剂组,这将为MI扩展型CompT™试剂组创建方案。除了如上节所述替换或添加不同的T细胞活化/衰竭标记物外,NK/NKT细胞分析也是有价值的潜在终点。这可通过在试剂组中添加CD49b/CD335标记物实现(图3)。

  

图3:扩展型CompT™试剂组定制可实现对未经治疗的MC38肿瘤衍生细胞中NK和NKT细胞亚群的分析。 CD3表达用于描述CD49b/CD335+ NK细胞和NKT细胞。 通过下游分析定量这些亚群中的粒酶B表达水平。
图3:扩展型CompT™试剂组定制可实现对未经治疗的MC38肿瘤衍生细胞中NK和NKT细胞亚群的分析。CD3表达用于描述CD49b/CD335+ NK细胞和NKT细胞。通过下游分析定量这些亚群中的粒酶B表达水平。

 

NK和NKT细胞是IFNγ的重要来源,对增强CD8+ T细胞的抗肿瘤反应具有间接作用,并可通过释放细胞溶性颗粒(如粒酶B)直接裂解肿瘤细胞。[7,8]其他选择包括IFNγ、TNFα或其他细胞因子分析,以对PD1+和PD1- CD8+ T细胞进行更深入的分析。也可增加CD103分析以检测常驻记忆T细胞,从而更深入地了解肿瘤中的记忆T细胞特征。科文斯的团队在研发定制流式细胞仪服务方面拥有丰富的经验。如要详细了解如何将扩展型CompT™试剂组整合到您的临床前研究中,请与科文斯的科学家联系。

1Jiang, Y.、Y. Li和B. Zhu。 "肿瘤微环境中的T细胞衰竭。" 细胞死亡与疾病 6.6 (2015): e1792。

2Klebanoff、Christopher A.、Luca Gattinoni和Nicholas P. Restifo。“CD8+ T细胞记忆在肿瘤免疫学和免疫治疗中的应用。” Immunological reviews 211.1 (2006): 214-224

3Mami-Chouaib、Fathia等人。 "常驻记忆T细胞是肿瘤免疫学中的重要组成部分。" Journal for immunotherapy of cancer 6.1 (2018): 87。

4Amatore、Florent、Laurent Gorvel和Daniel Olive。 "诱导协同刺激物(ICOS)作为抗癌治疗的潜在治疗靶标。" 关于治疗靶标的专家意见 22.4 (2018): 343-351。

5Miller、Brian C.等人。 "衰竭CD8+ T细胞亚群介导肿瘤控制并响应检查点阻断。" 《自然免疫学》 20.3 (2019): 326。

6Xiong、Huizhong等人。"在小鼠同源肿瘤模型中共表达活化和功能性CD8+ T细胞的抑制受体。" Cancer Immunology Research 7.6 (2019): 963-976。

7Zhu、Yanting、Bo Huang和Jue Shi。"Fas配体和裂解颗粒差异性地控制天然杀伤细胞针对癌症靶标的细胞毒性动力学。" Oncotarget 7.30 (2016): 47163。

8Zhao, Jie等人。"II型多克隆自然杀伤性T细胞需要PLZF和SAP才能产生和促进CpG介导的抗肿瘤反应。" 《美国国家科学院院刊》 111.7 (2014): 2674-2679。

 

注意:研究是根据适用的动物福利法规在AAALAC认可的研究中心进行的